Pada beberapa jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan berasal dr dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ni sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ni sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida sistemik.
Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminan permukaan berbeda, tergantung dr :
1. Jenis tanamannya.
2. Bagian tanaman dipergunakan.
3. Morfologi permukaan (misalnya: berbulu atau tidak).
4. Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan)
5. Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau).
6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa).
7. Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat).
Keadaan ni menyulitkan penentuan suatu prosedur sterilisasi standard berlaku untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur standard bisa dipergunakan untuk suatu jenis tanaman berasal dr tempat berbeda. Setiap bahan tanaman harus ditentukan melalu percobaan pendahuluan.
Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal penting harus menbisa perhatian ; bahwa sel tanaman & kontaminan ; sama-sama benda hidup. Kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Di negara-negara tropis, kontaminasi permukaan ni biasanya adalah hal cukup serius, hingga beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan.
Teknik Sterilisasi Eksplan
Beberapa jenis bahan bisa dipergunakan dalam sterilisasi permukaan eksplan, antara lain adalah:
Tabel 7. Macam- macam sterilan, kisaran konsentrasi & lama waktu perendaman :
No. Bahan Konsentrasi Lama Perendaman
1 Kalsium hipoklorid 1-10% 5-30 menit
2 Narium hipoklorid 1-2% 7-15 menit
3 Hidrogen peroksida 3-10% 5-15 menit
4 Gas Klorin - 1-4 jam
5 Perak nitrat 1% 5.30 menit
6 Merkuri klorid 0.1-0.2% 10-20 menit
7 Betadine 2.5-10% 5-10 menit
8 Benlate 2 gram/l 20-30 menit
9 Antibiotik 50 mg/l ½-1 jam
10 Alkohol 70% ½-1 menit
Bahan-bahan sterilisasi ini, pada umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman. Pembilasan berkali-kali sesudah perendaman didalam larutan sterilisasi. Sangat perlu dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif menempel di permukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi misalnya: perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam natrium hipoklorid & dibilas. Bisa juga perendaman dimulai dgnlarutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru merkuri klorid, & dibilas dgnair steril. Prosedur sama paling efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.
Sterilisasi bahan tanaman (misalnya: tunas kentang atau kencur), dimulai dgnpencucian & pembuangan bagian-bagian kotor & mati di bawah pancuran air ledeng. Pencucian bisa dilakukan dgnmenggunakan detergen lembut. Kadang-kadang bahan sudah bersih, dibiarkan dibawah pancuran air selama 1.2-1 jam untuk memecahkan koloni kontaminan pertaminan permukaan, agar koloni-koloni tersebut peka terhadap bahan-bahan sterilisasi (Gunawan, 1988).
Bahan sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ni harus lebih besar dr ukuran eksplan direncanakan. Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida dan/atau antibiotic. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan ditiriskan & dibawa masuk ke dalam laminar air flow cabinet. Prosedur lain dijalankan di dalam laminar air flow cabinet. Bahan-bahan tanaman dicelup dulu selama ½ menit dalam alcohol 70%, kemudian dimasukkan kedalam larutan natrium/kalsium hopoklorit diberi beberapa tetes bahan surfactant sepertti Tritone-x, Tween 20, atau Tween 80. Setelah waktu perendaman dalam larutan natrium/kalsium hipoklorid tercapai, bahan tanaman dibilas 3 kali dalam aquadest steril selama 10 menit untuk tiap pembilasan. Setelah semua prosedur tersebut dijalankan, berarti bahan tanaman sudah siap untuk ditanam.
Prosedur ni bisa dimodifikasi, misalnya dgnmenggunakan :
1. Fungisida/antibiotik – merkuri klorid – bilas dgnaquadest steril
2. Alkohol – sodium hipoklorid – merkuri klorid – aquadest steril.
3. Alkohol – sodium hipoklorid – betadine – aquadest steril.
4. & sebagainya, tergantung dr bahan digunakan.
Gambar 19: Sterilisasi pada daun africa violet ( Saintpaulia ionantha), sterilisasi
dimulai dgnmencelupkan daun pada alkohol 70%, dipindah ke larutan bleach 0,5%, dipindah ke larutan bleach 1 %, dipindah ke alkohol 70%, selanjutnya di bilas menggunakan aquades steril 4 kali (sumber: JA Negrón, UIPR Barranquitas, 2006).
Masing-masing peneliti & laboratorium bisa mengembangkan sendiri, cara paling efektif untuk keadaan setempat.
Dalam laboratorium mempunyai pompa vacuum, sterilisasi bisa dilakukan dalam keadaan vacuum & dikocok dgnmeletakkan botol di atas magnetic-stirrer. Hal ni bisa meningkatkan efisiensi sterilisasi. Ke dalam larutan juga ditambahkan surfactant beberapa tetes.
Bila gas klorin digunakan, maka prosedur harus dilakukan dalam fume hood atau lemari asam. Gas klorin bisa diperolh dgncara: 50 ml Clorox (bahan pemutih komersial/bleach), ditambah dgn5 ml HCL pekat. HCL pekat tak ditambahkan sekaligus, tetapi mula-mula 3 ml dulu, sesudah 3 menit bisa ditambahkan 2ml. Bahkan tanaman akan disterilkan misalnya umbi kentang & wadah berisi Clorox + HCL dimasukkan ke dalam botol besar tertutup (gambar 3.1).
Untuk menghindarkan pemborosan media perlakuan , bahan tanaman tak langsung ditanam di dalam media perlakuan . Eksplan terlebih dahulu di tanam di dalam media preconditioning adalah media komposisi dasar tanpa hormone, untuk menguji keefektifan prosedur sterilisasi. Setelah 3 – 7 hari di dalam media pre-conditioning & tak menunjukkan gejala kontaminasi berlebih-lebihan, sebaiknya dibuang. Untuk eksplan sukar diperolh & masih menunjukkan intergritas baik setelah sterilisasi pertama, sterilisasi kedua bisa dilakukan bila kontaminasi masih muncul di permukaan.
Dalam kasus kontaminasi internal, langkah bisa diambil ; perendaman bahan tanaman sudah dicuci bersih, didalam larutan antibiotik selama 4 – 5 jam. Kemudian prosedur selanjutnya, sama dgnsterilisasi permukaan bahan tanaman lain. Tindakan ni menolong keadaan tanman dgnkontaminan internal berupa bakteri. Cara lain bisa ditempuh, ; menambahkan antibiotic tepat kedalam media tumbuh. Apabila antibiotik digunakan termasuk heat-labile, maka antibiotik tak dimasukkan ke dalam media sebelum sterilisasi dgnautoklaf. Media di autoklaf tersendisi & antibiotic ditambhkan setelah difiltrasi dgnmicro-filter dgnpori-pori 0.2 um.
0 comments:
Post a Comment